一文读懂circRNA的命名规范与调控机制 | circRNA专题
环状 RNAs (circRNAs)是一类单链闭合的环状RNA分子，由mRNA前体（pre-mRNA）通过可变剪接（AS, Alternative Splicing）以及外显子环化或内含子环化产生，内源性环状RNA包括编码或非编码性RNA，不包含5'端帽结构和3'端poly(A)，因此不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定。近年来，随着转录组测序新技术的发展和应用，以及相应计算生物学分析流程的不断优化，研究人员在真核生物中发现了多达数十万条的外显子反向剪接环状RNA，并且在应用研究方面（干预细胞过程，调节免疫反应和直接翻译成蛋白质）为生物医学研究带来了许多新的启示。接下来，小编将围绕circRNAs的发展史、基础研究、医学应用以及目前正在推行的circRNAs命名规范展开讲述。
如下图所示，1976年，有学者在植物类病毒中首次发现单链闭合的circRNA。1979年，科学家借助电子显微镜观察到真核细胞质中存在circRNA。随后的几年，研究者先后在人丁型肝炎病毒和人体细胞中鉴定了circRNA，并发现circRNA不易被RNA外切酶降解，结构较稳定。1995年，研究报道在内部核糖体进入位点（IRES）的助力下，可实现工程化circRNA的异源表达。2010年-2015年，有研究报道了circRNA在代谢性疾病和肿瘤相关通路中发挥一定的调控作用，且发现了circRNA作为miRNA海绵的功能。2017年，circRNA可编码蛋白质的功能在多篇文章中报道。而就在这两年，我国研究工作者系统总结了circRNAs的特性、医学作用，并推进了circRNA的命名规范进程，说明circRNA相关研究已日益成熟。
图1 环状RNAs的发展史
大多数circRNAs由前体 mRNAs 的外显子反向剪接产生，circRNA与其同源线性RNA具有相同的初级序列是circRNA研究面临的主要问题之一，而目前研究学者基于最新的技术已经部分克服了环状RNAs结构和与线性同源mRNAs序列重合问题，以更好了解他们的细胞作用。CircRNA可以通过亚细胞定位与DNA、RNA 和蛋白质的特定相互作用，调节细胞质 mRNA 的稳定性和翻译，干扰信号通路，并在不同的生物学和病理生理学环境中作为翻译的模板。CircRNA在干扰细胞过程、调节免疫反应和蛋白翻译方面的新兴研究成果为生物医学研究提供崭新的思路。下面，我们将从中国科学院上海生命科学研究院陈玲玲研究员最新发表的Cell综述论文出发，介绍环状RNAs的研究方法、调控作用和潜在应用。
论文标题：Circular RNAs: Characterization, cellular roles, and applications
刊登日期：2022年05月
发表期刊：Cell
影响因子：66.850
研究机构：中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所
原文链接：
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092-8674(22)00468-8
1. 环状RNAs的注释和功能分类
图2 环状RNAs的注释和功能分类
首先，我们都知道，前体mRNAs通过剪接（splicing）的方式可产生线性RNAs，通过反向剪切（back-splicing）的方式可产生环状RNAs，并且环状RNAs的表达丰度普遍低于同源线性RNAs（图2A）。
由于缺乏游离末端，circRNAs在常规RNA-seq中被大量省略。对此，研究人员利用3’-5’核酸外切酶RNase R处理，通过生化富集方法进一步对circRNAs进行了富集。并在RNAse R反应缓冲液中添加了锂，完全降解了高度结构化的线性RNA （图1B）。此外，short-read测序或者long-read测序后，都需要基于特定算法将RNA-seq序列映射到整个反向剪切连接点（back-splicing junction, BSJ）位点来检测circRNA。但short-read测序将reads映射到外显子时可能同时包含circRNA和线性RNA，应用nanopore long-read测序（测序长度1000 nt）则可以区分circRNAs与其对应的线性RNA的reads，因此long-read测序可以更有效地对匹配到BSJ 区域的reads进行检测（图1C）。
虽然目前RNA-seq技术的灵敏度准确性较高，但我们仍要对候选circRNAs进行验证（例如通过RT-PCR和桑格测序技术、Northern blotting法）（图2D）。并且了解circRNAs的亚细胞定位、丰度以及编码和非编码功能对于解析它们的细胞作用也至关重要（图2E、F）。CircRNAs的构象一般通过化学探测方法进行探究，如20-羟基酰基化选择性分析（图2G）。此外，反义寡核苷酸可以用来识别circRNAs中包含BSJ的序列，体外合成的RNA环则可以作为引物来识别circRNA互作蛋白（图1H）。现阶段，在功能缺失表型研究方面，研究者主要通过RNAi和CRISPR技术干扰circRNAs的功能（图1I）。在circRNAs过表达研究中，构建过表达circRNAs载体的一个原则是同时保留产生circRNAs的外显子及其两侧的固有互补序列（ICSs）。这些载体一旦被转录，就会在两侧ICSs的帮助下产生circRNAs及其相应的线性mRNA(图1J)。而通过twister优化的RNA持久过表达系统，也可以对circRNAs进行过表达（图1K）。
2. 环状RNAs的主要生物学功能
CircRNAs可以调控转录与剪接，例如，ci-ankrd52与亲本基因座结合，形成R-loop，激活RNase H1介导ci-ankrd52酶切，破坏R-loop，促进转录延伸（图3A）。circSEP3与亲本的DNA基因座形成R-loop，导致转录暂停，产生外显子跳跃突变体（图3B）。可以作为蛋白海绵与MBL蛋白反馈调控，MBL可结合在circMbl内含子的侧端，促进circMbl的合成；同时高表达的circMbl会吸附MBL蛋白，影响MBL功能（图3C）。CiacGAS（抑制cGAS活性的circRNAs）可以通过一个短的dsRNA与cGAS结合，在维持造血干细胞静止状态中发挥作用，抑制cGAS介导的反应（图3D）。在免疫调控方面，部分circRNAs会形成较短的dsRNA区域，可结合并抑制细胞中dsRNA活化蛋白激酶R（PKR）（图3E）。CircRNAs能够与蛋白质结合形成RNA-蛋白复合体，调节信号通路（图3F）。此外，也可作为竞争性内源性RNAs（ceRNAs），吸附miRNA，从而调节miRNA对靶mRNA的作用（图3G）。CircRNAs还可以与mRNA结合，影响mRNA的稳定性和翻译（图3H）。CircRNAs还可以发挥竞争性结合的功能，与蛋白质的结合胜过其线性mRNA，导致mRNA翻译的改变（图3I）。
在蛋白翻译方面circRNAs可以作为多肽或蛋白质的翻译模板，除了调节基因表达的非编码作用外，circRNAs以非帽结构依赖的方式，借助于IRES启动蛋白质的翻译。CircRNAs的m6A RNA甲基化修饰也可以驱动circRNAs翻译合成蛋白质，circRNAs还可以利用其他的序列元件（如：IRES-like elements）来启动翻译（图4）。
3．环状RNAs的生物医学应用
3.1 环状RNAs的基因调控作用（非编码功能）
图5 环状RNAs的生物医学作用
CircRNAs在构象、稳定性和免疫原性上都不同于线性RNA，这一事实促使人们尝试开发基于circRNAs的技术，对CircRNAs在生物医学应用进一步探究。CircRNAs的具体应用包括：
（1）circRNAs适配体可以招募荧光传感器和有效代谢物生物传感器。
（2）circRNAs作为miRNA海绵，竞争性吸附miRNA，阻断其对mRNA的抑制。
（3）合成包含目标蛋白反应元件的circRNAs，作为蛋白海绵调节蛋白的活性。
（4）反义修饰的circRNAs靶向病毒基因组的保守区域，可阻断病毒的传播；或靶向mRNA募集ADAR进行RNA编辑。
（5）自剪接产生的circRNAs促进细胞内RIG-I表达和PKR激活，诱导先天性免疫级联。
（6）含有短dsRNA区域的circRNAs无细胞免疫原性，是参与内在免疫反应的PKR的有效抑制剂。
（7）可翻译的CircRNAs允许延长蛋白表达。
（8）circRNAs的产生具有组织特异性，靶向病理或疾病相关的circRNAs可作为疾病诊断的生物标志物。
3.2 环状RNA作为蛋白的翻译模板（编码功能）
图6 circRNA的序列设计（编码新冠S蛋白RBD三聚体）
基于circRNAs的结构稳定性、低免疫原性与蛋白翻译功能，研究人员可通过适当的序列设计和体外制备，编码任何感兴趣的蛋白。circRNAs代表一种新的基因表达平台，可以作为mRNA药物的增强或替代品。2022年3月31日，北大魏文胜课题组在《Cell》发表研究性论文：Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants。该团队首先建立了体外高效制备高纯度环状RNA的技术平台，针对新型冠状病毒及其变异株，设计了编码新冠病毒刺突蛋白（Spike）受体结构域（RBD）的环状RNA疫苗（图6）。
前面基于一篇陈玲玲研究员发表的Cell综述对环状RNAs的基础研究和潜在应用进行了简单阐述，其实大家可以发现，circRNAs的种类非常多，而其名称通常是模棱两可的，在研究中缺乏一致性。如下表所示，CIRCpedia (hg38, hg19)、circBank (hg19) 和 circBase (hg19) 使用基于 0 的坐标系，而 circAtlas (hg38) 使用基于 1 的坐标系。因此，根据数据库的不同，circRNAs 基因组起始位置的注释将相差一个碱基。因此，一个清晰的环状RNA命名系统是非常有必要的（尤其是一个能够让我们很容易知道成熟环状RNA中存在的宿主基因和确切的外显子和内含子的命名系统）。
表1 功能性的FAM120A环状RNA在每个数据库中的不同身份
那该如何赋予这些独特的circRNA以准确的名称呢？接下来，就让我们继续跟随陈玲玲研究员的脚步，来看看如何系统的对各种circRNA进行命名吧。
论文标题：A guide to naming eukaryotic circular RNAs
刊登日期：2023年01月
发表期刊：Nature Cell Biology
影响因子：28.213
研究机构：中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41556-022-01066-9
就在上月份发表的这篇NCB文章中，陈玲玲研究员受邀组织国际同行专家，对环状RNAs命名方法进行了系统梳理和总结，并提出了环状RNAs的命名方案，致力于推动环状RNAs命名规范化进程。
图7 环状RNA命名规范示意图
首先，为了命名由后剪接产生的环状RNA，专家们建议在现有“circ”前缀+基因名命名的基础上，建议加入对应外显子序号信息，以区分来源于同一个基因位置但具有不同外显子组成的环状RNA（图7B）。在这里，每个基因位点选择一个GENCODE/Ensembl转录本作为参考，建议使用标准化的参考转录本，如MANE（匹配注释来自NCBI和EMBL-EBI）转录本。为了说明这些提议的命名标准，作者们在下面提供了不同类型的环状RNA的例子（图7）。其次，不同BSJ位点的同一基因位点产生多个环状RNA，可以参考图7B和7C命名。另外，BSJ相同但内部剪接模式不同的环状RNA，可以参考图7D、7E、7F和7G命名。而当遇到含有先前未注释外显子的环状RNA，可以参考图7H和7I。最后，来自易位基因位点的融合环状RNA，可以参考图7J来进行命名。
在出版物中提供所有环状RNA名称的参考转录本是至关重要的。专家们呼吁作者、审稿人和编辑人员确保报告环状RNA的手稿需要提供：（1）基因组坐标和相关基因组组装；（2）环状RNA的完整序列；（3）任何以前给出的名字，例如在环状RNA数据库中的名字；（4）清晰的图表，以描绘出感兴趣的环状RNA在基因组中的位置。当几个环状RNA从同一基因位点产生时，这将有助于极大地促进交流和消除混乱。越来越多的环状RNA持续被识别，包括一些可能来自内含子自连接和一些来自非编码RNA。随着领域的发展，可以为这些新的转录本类提供额外的命名标准。
总结：
综上所述，小编总结了这两年陈玲玲研究员在circRNAs领域的最新研究进展。环状RNAs具有一系列转化应用场景：如作为RNA适配体、miRNA和蛋白质的分子海绵、反义RNA、调控细胞内天然免疫反应、蛋白质翻译载体及疾病相关分子标志物等，为进一步改造和利用环状RNA提供了新思路。过去的10年，circRNAs研究领域是机遇与挑战并存。目前研究已经证实，circRNAs是一种新的“程序化药物”，其潜能无限，可在体内表达任何治疗性蛋白，可能会取代或增强现有的药物使用模式。但是，许多低表达丰度circRNAs可以是剪接体副产物，因而可能不具有潜在功能，这也是需要注意的一点。未来，解决circRNAs在人类生长发育和疾病中的生理和病理作用仍然是至关重要。研究者认为随着研究的深入，circRNAs的其他作用将会被进一步发现，基于circRNAs的应用也将不断被实施。CircRNAs作为RNA适体、基因表达载体、临床靶点和生物标记物等方面的生物医学研究前景仍然非常可观。
鉴于在真核细胞中观察到的环状RNA种类繁多（以及许多不同的环状RNA可以从单个宿主基因中衍生出来的事实），陈玲玲研究员等多位专家共同号召大家使用规范的circRNAs命名方法：对于反向剪接产生的 circRNA 的名称，建议包括前缀“circ”，后跟宿主基因符号和外显子/内含子信息，如circFAM120A(2, 3)。对于来自内含子套索的ciRNA，也可以使用类似的策略来命名，即使用替代前缀“ci”。这种命名方案很直观，可用于命名任何真核物种中的环状转录本。专家们同时指出，环状RNAs的命名建立在国际标准基因和转录本命名基础上，因此提供配套的基因（和转录本）注释信息对于规范环状RNA命名至关重要。除了利用常规的NCBI和EMBL-EBI注释信息，MANE（Matched Annotation from NCBI and EMBL-EBI）注释信息也可用于环状RNAs的注释。因此，专家们提出的方案代表了一个临时解决方案，直到 circRNA 被纳入注释数据库，如 GENCODE 和 RefSeq。这样将是真正唯一的长期解决方案，这将消除 circRNA 名称中的歧义并消除对参考线性转录本的需要。
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